Mol Cancer|云平台助力上海市东方医院董春燕团队发现TNBC潜在治疗靶点ZNF526

三阴性乳腺癌（TNBC）是一种侵袭性恶性肿瘤，治疗选择有限，预后差。ZNF526的单核苷酸多态性rs3810151(p.Val94Ala)已被确定为乳腺癌易感位点，但ZNF526在TNBC中的功能作用和机制基础尚不清楚。 2025年11月，同济大学附属东方医院董春燕团队在 Molecular Cancer(IF33.9)发表了题为”ZNF526 drives tumor growth by enhancing SHMT1-dependent serine metabolism and antioxidant capability in TNBC”的文章。文章揭示了ZNF526是通过SHMT1介导的代谢控制TNBC中氧化还原平衡的一种新的调节剂，将其定位为TNBC的潜在治疗靶点。中科新生命为该研究提供了云平台分析服务。  


  研究材料 人乳腺癌组织样本、乳腺癌细胞、小鼠血清、肿瘤组织



  技术方法 转录组测序、非靶代谢组、ELISA、免疫组化、Chip-seq、DCFH-DA荧光检测、WB、RT-qPCR、ChIP-qPCR等；



  研究步骤 步骤1：通过TCGA数据分析ZNF526转录水平，预测患者总生存期，免疫组化检测蛋白水平； 步骤2：通过构建敲除和过表达细胞，观测细胞生长，以及通过流式细胞术分析细胞周期分布； 步骤3：代谢组学检测，确定显著富集SGOC相关代谢途径以及关键代谢物情况； 步骤4：DCFH-DA荧光法检测敲除或过表达细胞ROS水平； 步骤5：RNA测序发现关键通路关键酶，RT-qPCR和WB验证，荧光素酶检测启动子驱动的荧光素酶活性，Chip-seq验证SHMT1启动子区域富集情况； 步骤6：敲除或抑制znf526过表达细胞中的SHMT1，检测代谢物、ROS水平； 步骤7：建立小鼠异种移植模型，观测肿瘤生长、代谢物检测、免疫组化、SHMT1表达检测、ROS水平检测。


  研究结果 1. ZNF526在TNBC肿瘤组织中高表达，与预后呈负相关 通过TCGA数据库评估ZNF526 mRNA在乳腺癌亚型中的表达显示，ZNF526在肿瘤组织中的表达明显高于正常组织，且TNBC在所有亚型中ZNF526表达水平最高。另外，免疫组化分析显示，与正常对照（n = 35）相比，TNBC（n = 120）和非TNBC（n = 80）组织中ZNF526蛋白水平均显著升高，TNBC在所有组中表达水平最高。最后分析TCGA数据集，发现高表达的ZNF526预测TNBC患者较差的总生存期。相比之下，ZNF526在其他亚型中要么显示边缘阳性关联（luminal），要么没有预后价值（her2阳性）。 图1 ZNF526在TNBC肿瘤组织中高表达，与预后呈负相关   2. ZNF526促进TNBC中癌细胞生长 在MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20和HCC1806中产生了稳定的过表达ZNF526的细胞系。体外细胞生长实验表明，ZNF526过表达显著促进细胞生长，突变体ZNF526 （Val94Ala）在过表达时比野生型ZNF526表现出更强的促生长作用。构建shZNF526或ZNF526-KO稳定细胞系，shZNF526或ZNF526-KO显著抑制细胞生长。利用流式细胞术分析了细胞周期分布，ZNF526敲低诱导细胞系明显的G1期阻滞，相反，ZNF526在细胞中过表达降低了G1期比例，同时增加了S期比例。WB分析显示，ZNF526敲除下调了CCND1表达，抑制了Rb蛋白的磷酸化，同时上调了p21。而ZNF526过表达升高CCND1和phospho-Rb的水平，并降低p21的表达。 图2 ZNF526促进TNBC中癌细胞生长   3. ZNF526调节SGOC代谢和细胞GSH水平 对ZNF526过表达后细胞进行了非靶向代谢组学分析，MSEA显示，SGOC相关代谢途径显著富集，包括甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢，以及叶酸介导的单碳池，靶向代谢组学证实，SGOC通路的关键代谢物如GSH、SAM、5-甲基thf在ZNF526过表达时显著上调。测试SGOC主要分支的代谢物：嘌呤和嘧啶（核苷），SAM和GSH发现SAM和核苷都不能恢复ZNF526敲低引起的生长损失，补充谷胱甘肽可显著减轻shznf526诱导的细胞生长缺陷。进一步测量ZNF526敲除或过表达后细胞中GSH和GSSG的水平。结果表明，ZNF526基因敲除显著降低GSH/GSSG比值、GSH水平和总谷胱甘肽含量。相反，ZNF526过表达显著增加了这些参数，在突变体ZNF526- v94a过表达细胞中观察到的增加更为显著。 图3 ZNF526调节SGOC代谢和细胞GSH水平   4. ZNF526增强细胞抗氧化能力 测量ZNF526敲除或过表达后的细胞ROS水平发现ZNF526敲除显著提高细胞内ROS水平。相反，ZNF526过表达有效地减弱了ROS的积累，表达突变体ZNF526- v94a的细胞表现出更明显的ROS水平降低。进一步检测NAC发现NAC处理可有效降低ZNF526敲低诱导的ROS积累，并显著恢复细胞生长，以及H₂O₂处理显著抑制细胞活力，ZNF526过表达显著减弱了H₂O₂诱导的细胞活力丧失。 图4 ZNF526增强细胞抗氧化能力   5. ZNF526通过转录上调SHMT1的表达 RNA测序显示，ZNF526过表达显著上调了SGOC通路中的关键代谢酶SHMT1，RT-qPCR分析证实，ZNF526过表达显著上调SHMT1表达，而ZNF526敲低则大幅下调SHMT1表达。与野生型ZNF526过表达细胞相比，过表达突变体ZNF526- v94a的细胞表现出更明显的SHMT1 mRNA诱导。WB分析进一步在蛋白水平上得到验证。在HEK293T细胞中使用一系列由SHMT1启动子片段驱动的荧光素酶报告质粒进行了荧光素酶报告基因检测。结果表明，ZNF526显著增强了SHMT1启动子驱动的荧光素酶活性。缺失定位分析表明，ZNF526的潜在结合位点位于SHMT1转录起始位点（TSS）下游500 bp的区域内。利用JASPAR在线数据库进行进一步预测，确定了SHMT1启动子区域内两个串联排列的潜在znf526结合位点（指定位点1和位点2）。进一步设计荧光素酶报告基因结构，其中包含野生型SHMT1启动子、每个znf526结合位点（mut1或mut2）的单个突变或双突变（mut1 + 2）。报告者实验显示，两个结合位点的单个突变显著减弱了znf526依赖性荧光素酶的激活，而两个位点的联合突变完全消除了这种诱导。Chip-seq检测表明与对照IgG相比，ZNF526在SHMT1启动子区域显著富集。荧光素酶报告基因检测显示，与野生型ZNF526相比，突变体ZNF526- V94A诱导的信号传导明显更高，同样，ChIP-qPCR分析显示突变体ZNF526与SHMT1启动子区域的结合亲和力更强。分析了TCGA数据，观察到ZNF526和SHMT1 mRNA水平之间存在显著的正相关。此外，在TNBC患者中，SHMT1的高表达与较差的总生存率显著相关。 图5 ZNF526通过转录上调SHMT1的表达   6. SHMT1介导ZNF526的抗氧化和促生长作用 抑制过表达znf526的TNBC细胞中的SHMT1发现shmt1敲低显著减弱znf526诱导的谷胱甘肽升高，显著降低MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞中GSH/GSSG比值，SHMT1敲低明显减弱znf526介导的ROS抑制，提高MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞内ROS水平。ROS检测实验显示，SHIN1抑制SHMT1会损害ZNF526抑制MDA-MB-468细胞中ROS水平的能力。 图6 SHMT1介导ZNF526的抗氧化和促生长作用   7. ZNF526促进异种移植瘤模型的肿瘤生长 用MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞建立了小鼠异种移植模型。shZNF526明显抑制肿瘤生长，而过表达ZNF526则显著加速肿瘤进展，这与其促瘤功能一致。且与野生型ZNF526相比，表达ZNF526- v94a突变体的肿瘤表现出更强的生长优势。增殖标志物Ki67的免疫组化分析证实ZNF526正调控癌细胞增殖。体外观察，ZNF526敲低显著降低了SHMT1的表达，而ZNF526过表达则显著提高了SHMT1的表达水平。此外，ZNF526缺失导致显著的ROS积累，而ZNF526过表达抑制ROS水平。重要的是，GSH/GSSG比值在ZNF526敲除后显著降低，而在ZNF526过表达后升高，其中ZNF526- v94a突变体发挥了更明显的作用。进一步用特异性SHMT1抑制剂SHIN1处理过表达znf526的MDA-MB-468异种移植物小鼠。结果显示，SHIN1显著抑制了ZNF526过表达所带来的肿瘤生长优势，将肿瘤体积降低到与对照组相当的水平。与生长抑制一致，免疫组化分析显示，SHIN1处理后ki67阳性细胞显著减少。此外，SHIN1可有效诱导ROS积累。它还显著减弱了ZNF526过表达对ROS水平的抑制作用。用特异性SHMT1抑制剂SHIN1处理过表达znf526的MDA-MB-468异种移植物小鼠。结果显示，SHIN1显著抑制了ZNF526过表达所带来的肿瘤生长优势，将肿瘤体积降低到与对照组相当的水平。与生长抑制一致，免疫组化分析显示，SHIN1处理后ki67阳性细胞显著减少。此外，SHIN1可有效诱导ROS积累。它还显著减弱了ZNF526过表达对ROS水平的抑制作用。 图7 ZNF526促进异种移植瘤模型的肿瘤生长


  ZNF526 是三阴性乳腺癌（TNBC）中氧化还原稳态的关键调节因子。功能获得性 Val94Ala 变体（rs3810151）可通过提高自身转录效率，显著增强 ZNF526 的致癌活性。在机制上，ZNF526 通过转录激活丝氨酸羟甲基转移酶 1（SHMT1），进而促进谷胱甘肽（GSH）的生物合成，为肿瘤细胞赋予氧化应激抗性，最终推动肿瘤增殖。这些发现揭示，ZNF526 是 TNBC 中核心的代谢调节因子，通过直接抑制 ZNF526 本身或其下游 SHMT1/GSH 信号轴，有望为 TNBC 治疗提供新的潜在靶点。



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