Cell Metab｜恢复增殖，逆转衰老！中国科学院姬广聚/薛愿超及上中医吴红金团队发现外泌体miR-302b具有逆转衰老潜力

衰老是一个内在的生物学过程，其特征是系统改变，逐渐损害生理完整性，增加对年龄相关疾病的易感性，最终导致死亡。细胞衰老是一种由各种应激源触发的细胞周期稳定停滞状态，是衰老的重要驱动因素。 2025年1月，中国科学院生物物理研究所姬广聚研究员、薛愿超研究员联合上海中医药大学博鳌国际医院吴红金教授团队在Cell Metabolism杂志上发表了题为“Exosomal miR-302b rejuvenates aging mice by reversing the proliferative arrest of senescent cells”的文章。文章发现使用hESC-Exos靶向SnCs治疗是一种逆转衰老的潜在可行方法。  


  小鼠


  bulk RNA-seq、scRNA-seq、clip-seq、qPCR、免疫荧光显微、ELISA检测等


  步骤1：富集hESC-Exos后处理IMR-90细胞，进行bulk RNA-seq，测试衰老表型，SnCs恢复活力； 步骤2：scRNA-seq检测hESC-Exos处理对单个SnCs增殖的影响； 步骤3：hESC-Exos处理小鼠，记录生理属性和行为得分，收集血清进行ELISA和细胞因子实验，评估hESC-Exos的返老还衰作用； 步骤4：对小鼠肝脏和皮肤组织进行了scRNA-seq，检测hESC-Exos处理对体内细胞增殖的影响； 步骤5：运用qPCR、Clip-seq确定miR-302b含量及其调控信号和靶基因，并通过荧光素酶鉴定验证； 步骤6：制备Exos-302b外泌体治疗衰老小鼠，记录生理属性、行为得分、细胞因子结果研究miR-302b处理是否能使衰老小鼠恢复活力； 步骤7：验证miR-302b递送相关的长期安全性问题。 Senoreverse抗衰老策略


  1. hESC-Exos使衰老的IMR-90细胞恢复活力 使用hESC-Exos处理PDL50 IMR-90细胞72小时，观察到衰老表型的显著恢复。衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性降低，衰老和sasp相关基因（CDKN2A、CDKN1A、IL-1a、IL-11和CCL20）表达下调，在群体倍增实验中促进细胞增殖，细胞增殖标志物Ki67表达增加，S期细胞比例升高。 RNA测序表明，hESC-Exos显著抑制已知衰老相关基因的表达，如TP53、IL-6、CDKN1A和CDKN2A，同时增强增殖相关基因的表达，包括MKI67、PCNA、TOP2A和CDK1。基因集富集分析显示，hESC-Exos处理增强了细胞周期富集。这些发现表明，hESC-Exos处理可以使衰老的IMR-90细胞恢复活力，并重塑其增殖潜力。 图1 hESC-Exos使衰老的IMR-90细胞恢复活力   2. hESC-Exos在单细胞分辨率下逆转SnCs的增殖阻滞 构建衰老细胞系，并对其进行hESC-Exos或PBS处理，与PBS相比，hESC-Exos处理抑制了Dox诱导的增强的YFP信号和SA-β-gal活性，同时提高了增殖标志物Ki67的表达，hESC-Exos使一些SnCs重新进入增殖过程。 对FCM分类的SnCs进行了单细胞RNA测序，根据细胞周期进展对细胞进行排名，Dox-Exos在s期细胞的比例上优于Dox-PBS，大约增加了17%，UMAP显示，与Dox-PBS相比，Dox-Exos的Rej细胞比例增加，同时Sen细胞比例减少。 图2 hESC-Exos在单细胞分辨率下逆转SnCs的增殖阻滞   3. hESC-Exos治疗使衰老小鼠恢复活力 体内测试显示，hESC-Exos处理延长了衰老exos小鼠的中位寿命和最长寿命。25 ~ 30月龄，老化exo小鼠的体重高于老化pbs小鼠。且在各类衰老行为能力下降的检测中，老化- exos小鼠表现较好，下降时间明显延长。在老化- exos小鼠握力有所提高，在水迷宫测试中，老化exos小鼠定位平台的时间更短。此外，与衰老- pbs相比，hESC-Exos处理增加了衰老- exos小鼠在记忆阶段在目标象限的时间。 通过酶联免疫吸附试验定量检测白细胞介素(IL)-1β、干扰素(IFN)-γ、IL-6和肿瘤坏死因子α (TNF-α)进一步证实衰老- exos组显著降低。SA-β-gal染色显示衰老组织中SnCs的积累，这被hESC-Exos逆转。此外，hESC-Exos处理降低了DNA损伤标记γ-H2AX的表达，并增加了与基因组稳定性相关的标记H3K9me3的表达，病理分析进一步显示，hESC-Exos改善了衰老组织的病理特征，包括皮肤起皱、炎症反应和其他退行性变化。总的来说，hESC-Exos治疗将小鼠的衰老表型逆转到更年轻的状态。 图3  hESC-Exos治疗使衰老小鼠恢复活力   4. hESC-Exos处理重塑了衰老小鼠的增殖过程 对衰老- exos和衰老- pbs小鼠分离的肝脏和皮肤组织进行了scRNA测序发现，衰老减少了肝脏和皮肤组织中s期细胞的比例，hESC-Exos处理逆转了这一趋势。免疫荧光染色进一步证实，hESC-Exos处理抑制了老化肝脏和皮肤中Cdkn1a和Ccng2的表达。Cdkn1a和Ccng2是促进细胞周期阻滞和促进衰老的重要因素。hESC-Exos处理逆转了SnCs中的细胞周期阻滞，从而通过抑制Cdkn1a和Ccng2的表达来促进再生。 图4 hESC-Exos处理可重塑衰老小鼠的增殖过程   5. 在hESC-Exos抑制细胞周期检查点Cdkn1a和Ccng2中富集miR-302b 高通量测序显示miR-302b-3p在hESC-Exos中富集，进行Ago2交联免疫沉淀测序获得的候选位点与miRanda和TargetScan数据库的预测位点重叠。miR-302b在Cdkn1a和Ccng2的3 ' UTR上显示出较低的最小自由能。使用荧光素酶验证Cdkn1a和Ccng2的相对荧光活性明显降低。使用绝对qPCR检测miR-302b模拟转染后miR-302b水平显著升高，PDL50 IMR-90细胞中SA-β-gal活性的增强被miR-302b过表达显著抵消，流式细胞术显示，miR-302b过表达改善了s期细胞比例的减少，p21和Ccng2的表达水平升高也被miR-302b处理后减弱。由此推断miR-302b在体外通过抑制Cdkn1a和Ccng2的表达来促进年轻化。 图5 hESC-Exos中富集的miR-302b抑制细胞周期检查点Cdkn1a和Ccng2   6. miR-302b治疗可使衰老小鼠恢复活力 为了研究miR-302b处理是否能诱导体内返老，用miR-302b模拟物电转染来自293F细胞的外泌体，产生命名为Exos-302b的外泌体。25个月大的小鼠在连续施用Exos-302b期间，监测背部毛发恢复生长，小鼠体重增加。实验周期中，衰老-302b小鼠在27至30个月的表现优于衰老- nc小鼠，衰老302b小鼠的握力也显著提高，其他行为实验中也发现了使用miR-302b治疗后小鼠表现更良好。 此外，ELISA和细胞因子阵列分析显示，miR-302b的递送减轻了衰老小鼠循环中的慢性炎症。SA-β-gal染色显示，miR-302b的递送逆转了SnC在上述衰老组织中的积累。免疫荧光染色证实，miR-302b递送抑制了老化的肝脏、皮肤和大脑中Cdkn1a和Ccng2的表达。总体而言，miR-302b抑制Cdkn1a和Ccng2在SnCs中的表达，恢复其增殖能力并促进返老。 图6 miR-302b治疗可使衰老小鼠返老还童   6. 长期递送miR-302b减缓了衰老过程，没有引起安全问题 体重监测显示，27个月后，衰老-302b小鼠的体重明显高于衰老- nc小鼠，这表明miR-302b递送可能减轻与衰老相关的进行性体重减轻。与衰老nc小鼠相比，衰老302b小鼠的中位寿命延长了137天，死亡率风险比（HR）降至38%。混合效应Cox回归显示，与衰老- nc小鼠相比，衰老-302b小鼠的死亡风险显著降低。此外，比较aging-NC和aging-302b小鼠的最大寿命表明，两性合龄302b小鼠的最大寿命显著增加了12.13%。 miR-302b的递送改善了衰老小鼠的外观，死后病理检查显示，尽管衰老-302b小鼠寿命更长，但与衰老- nc小鼠相比，衰老-302b小鼠的肿瘤和疾病负担没有显著差异，两组之间的死亡原因相似。长期给药miR-302b延长了衰老小鼠的寿命，改善了衰老的可见迹象，不增加肿瘤或疾病负担，逆转了衰老组织内细胞增殖能力的下降，减轻了衰老相关的转录组特征，从而有效地减缓了衰老过程。 图7 长期递送miR-302b减缓了衰老过程，没有引起安全问题


  细胞衰老是衰老的一个标志，涉及细胞周期的稳定退出。衰老细胞（SnCs）与衰老和衰老相关疾病密切相关，使其成为抗衰老干预的潜在靶点。本研究证明了人类胚胎干细胞衍生的外泌体（hESC-Exos）通过恢复体外SnCs的增殖能力来逆转衰老。在衰老小鼠中，hESC-Exos治疗重塑了SnCs的增殖景观，导致了年轻化，这可以通过延长寿命、改善身体机能和减少衰老标志物来证明，且miR-302b治疗并不会带来安全性问题。


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