Sci Transl Med（IF15.8）| 多平台构建脑脊液蛋白质共表达网络，解析与托莫西汀治疗阿尔茨海默症相关的蛋白质变化

 

蛋白质是基因功能的直接执行者，相比于基因组和转录组，基于蛋白质标志物进行临床大队列研究具有更佳的广泛性、针对性和临床相关性。同时，蛋白质是常见的治疗靶点，可更好地促进新型诊疗方案的推广，便于临床成果转化（图1）。因此，利用蛋白变化作为指示生理状态的biomarker已在多种领域得到广泛应用，尤其在难以取得组织样本的情况下，使用血液、脑脊液、房水等样本表征大脑、眼睛等组织的发育或疾病状态已极为常见。

图1 蛋白质组在液体活检大队列研究中的应用优势
 

因着上述原因，从样本中检测出更多蛋白质是有效挖掘biomarker的关键。然而在实际应用，尤其临床研究中，蛋白质组数据挖掘仍面临多种难题：

1.队列样本个体异质性大，数据矩阵更复杂，蛋白质丰度存在多种缺失值，该如何处理？

2.常见蛋白质检测平台为：质谱、细胞因子检测、Olink和SomaScan，该如何选择？

3.不同检测平台对蛋白质种类检出是否有差异性？检测结果能否整合分析？

4.蛋白质变化能否反映出常规病理指标未反应的群体异质性？

不妨带着这些疑问，看看2024年6月发表在Science Translational Medicine（IF 15.8）杂志上一篇题为“Proteomic analysis of Alzheimer's disease cerebrospinal fluid reveals alterations associated with APOE ε4 and atomoxetine treatment”的阿尔茨海默症研究中，研究者是如何解决上述问题的。

 

 

 研究背景

 

 技术路线

 

 研究结果

1. TMT-MS和 SomaScan在脑脊液蛋白质检测种类和变化趋势上存在相关性

为更全面准确表征脑脊液中蛋白质的变化，分别使用TMT分级建库和SomaScan对脑脊液进行检测。在进行一系列质控并剔除75%的样本中都未检出到的蛋白质后，最终获得4576种蛋白质，其中SomaScan 3649种，TMT 2195种。维恩图表明，有1268种蛋白在两种平台中均被检测到（图2）。同时，两种平台分别有特异性蛋白质检出。对蛋白种类进行剖析，发现TMT-MS优先测量补体蛋白和免疫球蛋白，而SomaScan优先测量核蛋白。

图2 两种检测平台在检测蛋白质种类上的比较

注：质控方式：去除数据背景噪音、矫正TMT检测批次效应、过滤低信号检测值、去除在75%的样本中丰度缺失的蛋白质
 

从蛋白质丰度角度比较两种检测平台差异，无论是SomaScan还是TMT-MS，AD中增加的蛋白质数量相似，两个平台之间的重叠约为21%，更多下调蛋白被SomaScan检出（图3）。整体结果表明，每种平台优先测量的脑脊液蛋白质各有差异，两平台间的蛋白质信息可互补。

图3 从蛋白质丰度角度比较SomaScan与TMT-MS检测差异

注：F：两种平台结果（SomaScan，TMT-MS）分别进行差异分析得到差异火山图；G：两平台中共有上调或下调蛋白；

 

2. 整合两组学蛋白质丰度，构建高深度AD患者脑脊液蛋白质共丰度网络

由于SomaScan与TMT-MS检测到的蛋白质种类存在互补性，为更深度全面剖析脑脊液蛋白质组变化特征，研究者根据两平台共有蛋白测量值中位数信息，整合两种检测平台得到的蛋白质相对丰度，构建AD患者脑脊液蛋白质共表达网络。最终得到由34个模块组成的网络（图4A）。多数模块与AD至少一种表型指标相关，如M4模块（自噬/泛素化）与tTau相关性最强，M20模块（糖酵解/氧化还原稳态）与Aβ1-42相关性最强（图4B,D）。上述两个模块内蛋白均通过TMT-MS测量。

图4 SomaScan，TMT-MS平台蛋白质共表达网络

载脂蛋白E ε4（APOE ε4）基因型是迟发性AD的最强遗传风险因素，研究者发现与APOE ε4等位基因数量高度相关的三个模块由SomaScan独立检测得到，分别为M26（拟素化）、M33（氧化解毒/丝裂原活化蛋白激酶信号转导）和M34（线粒体）。其中M26、M33模块内蛋白在AD患者中下降并与APOE ε4等位基因数量的增加呈负相关（图5A-D）。而M34模块在AD和APOE ε4中显著增加，与认知功能、tTau和pTau181以及Aβ1-42有适度的相关性（图5E，F）。QTL分析表明，上述三类模块受APOE ε4基因型影响，并在另一项5400名冰岛队列的血清样本中发现，这三种模块与血清中的部分蛋白模块存在重叠。整体结果表明，可利用SomaScan和TMT-MS构建AD脑脊液蛋白共表达网络，该网络揭示Aβ和tau失调间的多种病理变化，包括APOE ε4基因型控制下的变化，并且脑脊液共表达捕获的神经元生物学特征可部分反映在血清中。

图5 AD脑脊液网络模块与APOE ε4等位基因数量相关

 

3. 血液中M33氧化解毒/MAPK信号和M34线粒体模块与诊断前至少21年发生的痴呆相关

由于M26、M33和M34模块与血液中部分蛋白模块重叠，为进一步确定这些蛋白是否与血液中APOE ε4相关？作者在一项纵向队列研究中（5457名冰岛人），使用SomaScan检测血清蛋白，发现三种APOE ε4模块特征蛋白（模块第一主成分蛋白）与血清APOE ε4的相关方向、脑脊液中APOE ε4的相关方向相同，其中M33和M34的相关性特别强（表1）。且M33和M34与流行AD和偶发AD都有关联。

表1 AGES-Reykjavik和ARIC队列中，血液中脑脊液APOE ε4模块合成蛋白APOEε4的关联

同样，作者在一项社区动脉粥样硬化风险（ARIC）研究中测试了血浆中得到的脑脊液模块特征蛋白与APOE ε4，痴呆发生率的关联。发现在平均21年的随访中，三个模块都与痴呆的发生有关（图6）。整体结果表明，在脑脊液中观察到的与APOE ε4密切相关的蛋白（M26、M33、M34）也与血液中APOE ε4呈相同方向变化，且这些模块内的蛋白在血液中的丰度变化与21年后AD或痴呆发生相关。

图6 脑脊液AD网络与血液蛋白质网络重叠

 

4. AD患者的脑脊液蛋白质网络模块受ATX治疗的影响

既然脑脊液的蛋白质共表达模块可深入了解AD病理生理的不同差异。在临床治疗干预下，这种共丰度网络是否受到影响？若受到影响，治疗后产生的变化能否转化为临床诊疗标志物？

随后，研究者使用去甲腺素再提取抑制剂（ATX）治疗因AD引起的轻度认知障碍患者，在治疗前后收集脑脊液样本进行TMT-MS和SomaScan检测，并将ATX比率（n=18 ATX/安慰剂和n=16 ATX/基线，总n=34）与患者内部安慰剂与基线比率（安慰剂/基线，n=18）进行比较，以衡量由ATX引起的治疗效果。发现4个模块受到ATX治疗的影响，分别为M20（糖酵解/氧化还原稳态）、M21（细胞外基质（ECM）/血管系统）、M14（翻译）、M16（歧义）。其中M20与AD内表型密切关联，由65种蛋白质构成，在AD中强烈升高，ATX治疗6个月后，M20模块内蛋白丰度下降较大，以增加大脑代谢功能（图7）。

图7 ATX治疗对AD CSF网络模块的影响
 

研究者进一步利用8种蛋白质的组成比例预测M20模块内蛋白变化，发现其有良好的预测效果。整体结果表明，ATX治疗可改变因AD引起的认知障碍患者脑脊液蛋白共丰度网络，且这种变化可通过M20模块蛋白或M20模块应答蛋白的比率进行预测。

 

5. 脑脊液蛋白共丰度网络发现Aβ、tau未表征的病理异质性

为从蛋白水平对参与者再次分组，对每个模块内连通性前10的枢纽蛋白进行聚类可将296名参与者重新分为10个亚组，并根据蛋白丰度相似性将10个亚簇再次聚集为3大超簇（图8）。比较不同亚簇中参与者的Aβ、tau特征发现，第10亚簇群体具有基于Aβ和tau诊断标准的统一成员。第3，6亚簇蛋白丰度相似性与第10组关系最为密切，属同一超簇，但在关键蛋白上存在一定差异，如：神经元模块M8（信号蛋白信号）、M15（神经素/突触膜）、M24（轴膜/信号蛋白复合物）、M11（轴突）；APOE相关模块：M33（氧化解毒/MAPK信号）和M26（类泛素化）的蛋白丰度在3和6亚簇人群中更高，而M34（线粒体）的丰度较低（图8）。

图8 基于CSF AD蛋白质组网络特征对个体进行分组

第1，2，7组在第二超簇中，包含基于Aβ和tau标准的AD和对照人群，一些关键的脑脊液蛋白特征上存在不同，包括上述神经元模块和M4（自噬/泛素化）丰度较低，M2（补体/凝血）丰度较高；第4、5、8和9亚簇组成第二类超簇，这一超簇中既有由Aβ，tau定义的对照病例(第4组和第5组)，也有高比例的AD病例。M20（糖酵解/氧化还原稳态）模块可将该超簇中AD人群和对照人群区分开（图8）。整体结果表明，基于脑脊液蛋白质组谱的个体聚类揭示了Aβ和tau未完全反应的病理变化异质性。

 

 

总结

1.不同检测平台为AD患者脑脊液中蛋白质的深度检测奠定重要基础。无论是从蛋白质种类还是丰度上，TMT-MS与SomaScan均存在一定的重叠和特异性，两平台数据可相互补充；

2.可使用TMT-MS与SomaScan共同检测到的蛋白质对两种检测方案得到的蛋白质丰度进行整合，使测到的蛋白均参与分析，构建脑脊液蛋白质共表达网络，呈现出与Aβ和tau病理相关的蛋白质组学景观。挖掘出与APOE ε4风险基因型密切相关的三个模块（M26、M33、M34），并与先前描述的血清脂蛋白模块重叠；

3.ATX 2期治疗可降低因AD引起的认知障碍患者，脑脊液中糖酵解相关模块的蛋白丰度，以减轻病状。

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参考文献

[1] Dammer EB, Shantaraman A, Ping L, et al. Proteomic analysis of Alzheimer's disease cerebrospinal fluid reveals alterations associated with APOE ε4 and atomoxetine treatment. Sci Transl Med. 2024 Jun 26;16(753):eadn3504.

 

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