蛋白质组学为促进人类健康和环境提供了巨大的潜力，越来越多的专家学者致力于在系统生物学和大型临床队列的应用研究。MS数据采集已从数据依赖采集(DDA)转变为数据非依赖性采集(DIA)。更快、更灵敏的MS仪器以及先进的数据处理软件，使DIA成为无标记分析中最大化蛋白质组覆盖率的方法。

近期，丹麦哥本哈根大学诺和诺德基金会蛋白质研究中心的Jesper V. Olsen和赛默飞世尔科技质谱研发团队在国际顶刊Nature Biotechnology（IF 46.9）在线发表了创新研究成果“Ultra-fast label-free quantification and comprehensive proteome coverage with narrow-window data-independent acquisition”。该研究介绍了一种在Orbitrap Astral质谱上实现的名为“narrow-window data-independent acquisition （nDIA）”（窄窗口式数据非依赖性采集）的质谱技术，旨在实现快速、可重复的全面蛋白质组定量分析。

研究结果

1. Astral质谱DDA和DIA的性能评估

作者详细描述了Astral质谱仪的结构和工作原理（图1 a），窄窗口式数据非依赖采集（nDIA）策略，包括高分辨率 MS1 扫描和使用 2Th 隔离窗口的约200 Hz并行串联质谱（MS/MS）扫描，可模糊DDA和DIA方法之间的界限。比较2Th窗口宽度的DDA和DIA的结果，发现在nDIA模式下，超过 200Hz的采集速度, 生成约40w DIA MS/MS光谱（图1 bc）；在DDA模式下，MS/MS整体光谱强度更高（图1 d）；但DIA鉴定量更高，定量蛋白的数目接近10000个，重复性好，蛋白变异系数（CV）低于20%的占比较高（图1 e-g）。再来评估Astral质量分析仪在MS/MS模式下提供的质量准确性，结果发现具有ppm级的质量精度（图1 h-j）。

图1 nDIA与DDA的性能评估

 

2. 深度蛋白质组分析

全面深度覆盖的蛋白质组学研究对于大规模系统生物学研究非常重要。研究者选用酵母细胞在不同方法下对蛋白组学覆盖能力进行研究。在酵母细胞的分析中，采用新的窄窗口式数据非依赖采集（nDIA）方法，成功实现了对约4500种蛋白质的快速、高效分析，实现了近乎完整的酵母蛋白质组覆盖，比之前的研究速度提高了10倍（图2 a）。在对人胚胎肾细胞（HEK293）的不同上样量试验中，nDIA可实现对人蛋白质组的高通量、高灵敏度和高定量再现性的分析，多达9619个蛋白质的高度可重复的鉴定（图2 b-d）。

图2 不同条件下的深度蛋白质组

 

3. nDIA可实现精确、准确的无标记定量

为了测试Astral定量的准确性，利用六种不同比例的人细胞、酵母和大肠杆菌蛋白质组成的混合样本，200ng和800ng的HEK293细胞裂解液使用Orbitrap Astral 质谱仪在28分钟的梯度下，与500ng上样量使用Orbitrap Exploris 480 质谱仪45分钟梯度相比，鉴定到超过2倍的蛋白质和3.5倍的肽前体。Orbitrap Astral 质谱仪表现出较高的可重复性，90%左右的蛋白质CV（变异系数）<20%，并且三次技术重复中缺失值的数量很少（约3%）（图3 ab）。并比较了MaxLFQ与QUANT2.0两种算法对定量准确性的影响，结果表明MaxLFQ算法实现超过99%的前体进行蛋白质定量。

图3 不同物种混合比例的蛋白质组定量分析

 

4. 通过分级多次上样实现深度蛋白质组

研究人员为了探索更高深度的蛋白质组，进行多个馏分上机测试，HEK293细胞的胰蛋白酶消化物分46、34、23或12级，每个分级方案三个生物学重复，结果表明180SPD方法鉴定到约246000个肽、12328个蛋白质。与单针分析相比，通过分级的方法鉴定到了一些低丰度的重要的信号蛋白，包括跨膜受体和转录因子。34分级方法定量的蛋白质数量在覆盖率方面与HEK293的RNA测序数据在基因水平上重叠88.8%。并且鉴定约2700个N-乙酰化位点, 4000个磷酸化位点。 

图4 分级深度蛋白组学


 

小结

综上，该研究建立了一种基于Orbitrap Astral高分辨质谱的窄窗口数据非依赖采集技术（nDIA）方法，在定性定量和灵敏度方面具有优异的性能，可实现短时间内对全面蛋白质组的高通量分析。

 

中科新生命自2016年开始提供商业化的DIA定量蛋白质组学服务至今，已形成了从高通量检测到分析的完整技术平台，开发了特色激酶分析及与其他组学的联合分析方案，已助力客户发表了几十篇高分文章。Orbitrap™ Astral™高分辨质谱仪问世以来，其更高通量、更深覆盖、更高灵敏度及精确定量的显著优势已深入人心。