研究结果

1. DCA抑制CD8⁺ T细胞的效应功能

用73种细菌代谢产物处理CD8⁺ T细胞24小时。发现DCA大大减少CD8⁺ T细胞的细胞毒性和CD8⁺ T细胞中IFN-γ⁺细胞比例的倍数变化（图 1A-C）。此外，DCA对GzmB⁺, IFN-γ⁺, TNF-α⁺表达的抑制作呈剂量依赖性，从150 mM DCA开始变得明显（图1D-F）。所以DCA可以抑制CD8⁺ T 细的活化。

图1 DCA抑制CD8⁺ T细胞的效应功能

 

2. DCA通过抑制Ca²⁺-NFAT2信号传导抑制CD8⁺ T细胞效应功能

CD8⁺ T细胞的活化涉及到钙离子信号通路，因此，研究人员想知道DCA是否是通过影响钙离子信号通路通路来抑制CD8阳性T细胞的效应功能。CD8⁺ T细胞的实时荧光强度数据显示，DCA抑制胞质Ca²⁺ 积累（图2A-B）。DCA处理后的CD3 / CD28抗体活化的CD8⁺ T细胞抑制了NFAT2的入核以及转录活性（图2C-D）。DCA通过抑制Ca²⁺-NFAT2信号传导抑制CD8⁺ T细胞效应功能（图2E-2G）。

 

图2 DCA通过抑制Ca²⁺-NFAT2信号转导抑制CD8⁺ T细胞效应功能

 

3. DCA通过PMCA抑制Ca²⁺-NFAT2信号转导

进一步，研究人员想知道，细胞质中钙离子的减少，究竟是因为钙离子从细胞质外流到细胞外了，还是从细胞质内流到细胞器中了。于是，研究人员着重关注了几个钙泵，包括细胞膜上的PMCA、内质网上的SERCAs和线粒体上的MCU。DCA 处理后CD8⁺ T细胞，使用PMCA抑制剂可增加IFN-γ⁺和TNF-α⁺ 的表达，增加细胞毒性和NFAT2 的核易位（图3A-3C）。使用shRNA抑制PMCA4表达后，同样抑制了CD8⁺ T细胞效应功能，（图3D-F）。这些结果表明，研究人员发现，PMCA抑制剂可以改善经DCA处理后的CD8+ T细胞的效应功能，而阻断SERCAs和MCU则没有效果。进一步研究DCA和PMCA之间的关系，我们使用生物素标记的DCA 进行免疫共沉淀，然后用链霉亲和素磁珠将结合物分来出来，发现DCA与PMCA4有很强的相互作用（图3G）。同时发现DCA的加入促进了PMCA4的ATP酶活性（50%），但未增强SERCA的ATP酶活性（图3I）。综上所述，这些结果表明，DCA可通过与细胞膜上的PMCA结合，加速了钙离子外排，进而影响了钙离子-NFAT2信号通路，最终抑制了CD8⁺ T细胞的效应功能。

图3 DCA通过PMCA抑制 Ca²⁺-NFAT2信号转导

 

4. DCA通过抑制抗肿瘤CD8⁺ T细胞免疫反应来促进肿瘤生长

鉴于CD8⁺ T细胞在肿瘤免疫监视中发挥作用，我们推测DCA对 CD8⁺ T细胞效应功能的抑制可能促进结肠癌（CRC）发展。为此，给CRC鼠标模型口服或腹膜内注射DCA后检测肿瘤区域GzmB⁺, IFN-γ⁺, TNF-α⁺表达情况（图 4A-G）。将B16-OVA细胞和 DCA处理过的OT-1 CD8⁺ T细胞（皮下）注射到 Rag1^-/-小鼠上，发现DCA在很大程度上抑制了抗原特异性CD8⁺ T细胞的抗肿瘤作用（图4H-J）,表明 DCA 直接抑制CD8⁺ T细胞毒性。在没有CD8⁺ T细胞的情况下，DCA处理没有加剧肿瘤生长（图4O-P）。在有CD8⁺ T细胞Rag1^-/-小鼠植入癌细胞，DCA处理仍能致肿瘤生长加速和CD8⁺ T细胞效应功能受损（图 4R-4T）。说明DCA需要依赖CD8⁺ T细胞调节肿瘤生长。

 

图4 DCA通过抑制抗肿瘤CD8⁺ T细胞免疫反应来促进肿瘤生长

 

5. DCA的积累与CRC患者CD8⁺ T细胞效应功能受损相关

使用免疫组化（IHC）评估来自同一患者的肿瘤切片的GzmB⁺, IFN-γ⁺, TNF-α⁺。这3个指标与DCA浓度/baiF基因表达呈负相关（图5A-5D）。C. scindens（可将柠檬酸转化为DCA的菌）培养上清含有DCA，抑制CD8⁺ T细胞的效应功能（图5E-5J）。此外，C. scindens定殖小鼠可加速肿瘤生长，而胆汁酸螯合或靶向C. scindens的噬菌体可消除这种促瘤作用（图5L-5R）。

图5 DCA的积累与CRC患者CD8⁺ T细胞效应功能受损相关


总结

DCA可以与CD8⁺ T细胞膜上的钙泵（PMCA）结合，促进了细胞内钙离子外排，抑制了细胞内钙离子-活化T细胞核因子（NFAT）2信号传导，最终影响CD8⁺ T细胞的活化和效应功能。通过胆汁酸螯合，以及靶向C. scindens的噬菌体可以有效阻止小鼠结直肠癌的进展。