研究材料

额叶皮质组织FFPE（疾病组142个，对照组92个）
   

步骤1：使用甲基化芯片检测样品DNA甲基化程度；

步骤2：通过EWAS-META分析确定病理亚型中共有差异甲基化CpG位点；

步骤3：差异甲基化位点基因下游组学验证；

步骤4：WGCNA分析共甲基化网络；

步骤5：关键模块功能富集和细胞类型分析。

 

研究结果

1. FTLD中不同细胞类型DNA甲基化程度存在明显差异

基于神经元(NeuN+)、少突胶质细胞(SOX10+)和其他脑细胞类型(NeuN−/SOX10−)的分类，观察到不同疾病亚型中细胞类型分布比例存在广泛差异，除PSP病例(FTLD3)外，与对照组相比，所有疾病亚型的神经元比例均显著减少，这与神经退行性疾病的预期一致。

图1 根据疾病组和对照组DNA甲基化数据得出的脑细胞类型比例

 

2. 通过EWAS-META分析确定FTLD病理亚型中共有差异甲基化CpG位点

单队列差异计算发现，FTLD3队列中差异显著性最高的位点是cg09202319，疾病组中甲基化程度较低。该位点映射到PFDN6 启动子区域的CpG岛，该区域参与促进细胞骨架蛋白的组装。

META分析单队列EWAS结果，确定了两个差异甲基化的CpGs，分别映射OTUD4（在疾病组中低甲基化），FATC1（在疾病组中高甲基化）。

图2 跨队列EWAS-META分析中发现的差异甲基化位点

 

3. 差异甲基化位点基因下游组学验证

转录组中，OTUD4和NFATC1在FTLD疾病组中mRNA表达水平上调（OTUD4在5’UTR区呈低甲基化，上游调控区的DNA甲基化水平通常与基因表达水平呈负相关；NFATC1在gene body区呈高甲基化，基因体中的DNA甲基化水平通常与基因表达呈正相关）。蛋白组学中，FTLD疾病组中OTUD4蛋白表达上调；NFATC1蛋白未检测到。

OTUD4作为去泛素化酶参与RNA结合蛋白（RBP）互作以及颗粒形成、mRNA翻译；NFATC1则与神经元兴奋性、轴突生长、突触可塑性、神经元存活相关；以上功能紊乱会引起神经性退行疾病。

图3 OTUD4和NFATC1的转录水平和蛋白水平比较

 

4. WGCNA分析共甲基化网络

基于WGCNA分析确定共甲基化网络，锁定高度链接模块，以及关键模块特征基因ME，找到共有ME，并与FTLD病理相关特征完成相关性分析；三个“otud4模块”都与疾病状态呈负相关，即组成这些模块的CpGs中甲基化水平较低与FTLD风险增加相关，且“otud4模块”中存在多数与OTUD4互作蛋白位点。

图4 FTLD共甲基化网络的模块-性状相关性

 

5. 关键模块功能富集和细胞类型富集分析

“otud4模块”的GO功能富集集中在转录调控、磷酸化、泛素系统和肌动蛋白细胞骨架动力学等相关功能；细胞类型富集分析发现主要发生在锥体神经元、谷氨酸能神经元细胞、内皮/壁细胞中。谷氨酸和谷氨酸信号失调是FTLD疾病的一个重要表现。

图5  “otud4模块”GO富集和细胞类型富集结果

 

小结

本研究确定了FTLD受试者死后额叶皮质组织的全基因组DNA甲基化变化，突出了新的FTLD相关位点，并暗示DNA甲基化是FTLD中泛素和谷氨酸能信号传导等重要过程失调的机制。研究的发现增加了对FTLD生物学和DNA甲基化在其病理生理学中的作用的理解，为治疗开发指出了新的途径。

 

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