一直以来，被广泛用于标识神经激活的分子标志物是一些即刻早期基因（IEG）如FOS等。但尚无相当的可用于标识神经活性下降/关闭的分子标志物。蛋白质翻译后修饰(PTM)，如磷酸化，受到细胞活动快速、双向的调节，具备作为细胞活动“开关”标志物的分子基础。
2024年1月17日，美国斯克里普斯研究所的研究者在神经科学领域顶刊Neuron(IF:16.2)上在线发表了题为“Phosphorylation of pyruvate dehydrogenase inversely associates with neuronal activity”的论文。该研究利用光遗传技术+磷酸化蛋白质组发现了一个不同于以往标识神经活性上升/开启的、可灵敏标识神经活性下降/关闭的标志物——pPDH(磷酸化的丙酮酸脱氢酶)。此种逆活性标志物（IAM）可以与IEG或其他标志物一起用于描述和识别由经验或行为诱导的双向神经动力学。

 

研究材料

基于光遗传技术诱导的低活性和高活性的原代皮层神经元；

小鼠模型（麻醉、化学遗传学、视觉刺激、水剥夺-饮水、禁食-重新进食）


技术路线
步骤1：建立基于光遗传技术的神经元激活平台；
步骤2：磷酸化蛋白质组检测发现磷酸化PDH(pPDH)与神经活性负相关；
步骤3：在原代细胞中，pPDH与神经活性动态相关；
步骤4：在体内，pPDH与实验诱导的神经活性抑制相关；
步骤5：pPDH与感官体验诱导的神经活性负相关；
步骤6：pPDH和即刻早期基因（IEG）联合指示内在状态诱导的神经激活和抑制；
步骤7：pPDH揭示与外侧下丘脑进食行为相关的细胞类型神经动力学。


研究结果

1. 建立基于光遗传技术的神经元激活平台

研究者在原代皮层神经元上表达光敏感通道蛋白（channelrhodopsin-2，ChR2）以建立基于光遗传技术的神经元激活平台。光刺激后可产生大量同步、精确放电模式的神经元。在10cm²面积上，10ms，5mW/mm² 470nm的光刺激就足以激发高达10HZ的动作电位，在同一时间获得超过10⁶个有同步动作电位的神经元。这些激活的神经元的即刻早期基因（IEG）如Fos、Arc和Npas4的mRNA表达显著升高。

图1 光遗传技术获得同步、精确放电模式的神经元

 

2. 磷酸化蛋白质组检测发现磷酸化PDH(pPDH)与神经活性负相关

研究者对动作电位发射为0.5HZ（慢，低活性）和10HZ（快，高活性）的神经元进行了磷酸化蛋白质组检测，共检测到了7543个磷酸化肽段、约50个显著性差异磷酸化肽段。两个下调的磷酸化位点PDH E1亚基α 1a的Ser293和Ser300（PDHA1a，研究者称为pPDH）被挑选作为后续研究的目标。

PDHA1a是丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）中的限速酶，控制丙酮酸进入氧化三羧酸循环（TCA）。TCA的激活被证明是神经元放电所必需的。PDH的磷酸化抑制酶活性，而它的去磷酸化则激活PDH，进而产生更多的ATP。这一结论与研究者发现在神经元高速放电时（高活性）pPDH显著下调相一致。研究者认为，在神经元高度活跃时，PDH去磷酸化，增加ATP的产量以满足神经元对能量的高需求。基于这种功能相关性和易于获得商业化单克隆抗体，研究者决定测试pPDH是否可以作为逆活性标志物（IAM）。

图2 磷酸化蛋白质组检测发现pPDH与神经活性负相关

 

3. 在原代细胞中，pPDH与神经活性动态相关

PDH Ser293和Ser300的磷酸化在原代神经元中同时被检测到。研究者继续对小鼠不同脑区中这两个位点的磷酸化进行了检测，发现pSer293 PDH是in vivo的主要形式。因此，研究者重点关注pSer293 PDH。

在5HZ连续光遗传刺激条件下，研究者检测到了比10HZ条件下更低的pPDH。在停止激活50min后，pPDH恢复到和基线相当的水平。药理抑制后，pPDH的上升，并在加入KCl后反转。以上结果表明pPDH可以受到神经元活性的双向和反向调节。

图3 在体外，pPDH与神经元活性负相关

 

4. 在体内，pPDH与实验诱导的神经活性抑制相关

研究者接下来检测pPDH是否可以作为体内神经活性的组织学标记。研究者首先检测异氟烷麻醉导致的神经活性抑制后pPDH的水平。结果显示，麻醉2h导致脑区广泛的FOS免疫荧光信号的缺失，而研究者在多个脑区检测到了pPDH的显著上调。与早前报道一致的是，研究者同样发现，麻醉导致视上核区有显著上升的FOS，而高pPDH则在该区一群离散的神经元中被检测到。此外，并不是所有区域都表现为高pPDH，如海马的CA3区域、血脑屏障（BBB）外区，pPDH并不响应异氟烷麻醉。因此，和即刻早期基因（IEG）一样，pPDH标记也有区域偏好、偏差和差异。有趣的是，在一个非常早期的时间（麻醉后1h），脑区就可检测到强的pPDH，而FOS的缺失则不明显，这反映出与即刻早期基因（IEG）的表达相比，pPDH有更快的动态特性。

图4-1 pPDH与麻醉中的神经活性负相关
 

此外，研究者还发现pPDH可以标记被常见电路操作法如化学遗传学技术沉默的神经元。

图4-2 pPDH与化学遗传学技术诱导的神经活性负相关

 

5. pPDH与感官体验诱导的神经活性负相关

研究者继续采用一种小鼠视觉刺激方案以检测视觉通路中pPDH的动态变化。小鼠首先在黑暗中保持48小时(视觉剥夺)，然后暴露在明亮的视觉刺激下4小时以诱导神经元活动，然后再次回到黑暗中2小时和12小时（此时视觉刺激诱导的活动预计会消退）。与文献报道一致，初级视觉皮层(V1)、外侧膝状体核(LGN)和边缘内嗅皮层(LEnt)的FOS信号在4小时的视觉刺激下被强烈诱导，在第二次黑暗环境12小时后才缓慢恢复到基线水平。相比之下，小鼠重新进入黑暗环境2小时后，所有三个区域的pPDH信号都显示出急剧增加，这表明视觉刺激的停止(从而降低了视觉通路的激活)可以被pPDH快速捕获。基于细胞标记染色可知，大多数pPDH标记的细胞是NeuN+神经元。

图5 pPDH与视觉刺激中神经活性负相关

 

6. pPDH和即刻早期基因（IEG）联合指示内在状态诱导的神经激活和抑制

研究者继续采用小鼠水剥夺（WD）和饮水模型检测水稳态关键区MEPO（正中视前核）中pPDH的变化以确认pPDH是否可以标记行为或内在状态诱导的神经活性。小鼠在重新可获取水前被剥夺水24h。结果显示，水剥夺后MEPO区的FOS显著上升，在重新可饮水后1h，pPDH显著上升，而FOS在可饮水8h后才缓慢恢复到基线水平，再一次反映出在pPDH和FOS标记在关-动力学（off-kinetics）中的差异。

接下来，研究者检测水剥夺下全脑区的FOS和pPDH水平。结果显示，在FOS高表达的前几个脑区都有显著下降的pPDH，这表明pPDH可以以一种与FOS相反的方向标记神经活性变化。研究者开发了pPDH免疫染色的抗体和操作方法，并发现水剥夺导致的显著变化在超过10个脑区中能由pPDH的显著下降显示出来但并不能通过FOS染色变化显示出来，这提示我们通过联合pPDH和即刻早期基因（IEG）可以发现一些新的neural substrates。

图6-1 在水剥夺模型中，pPDH与神经活性负相关
 

此外，研究又在禁食和重新进食的小鼠模型中发现，禁食后的ARC区呈现显著升高的FOS信号和降低的pPDH信号。但在重新进食1h后，并不能检测到FOS信号的下降但可以检测到很强的pPDH信号上升。综上所述，这些数据表明pPDH提供了一种以前无法通过现有的基于IEG的活性标记物从组织学上标记神经元抑制的方法，并直接证明了使用pPDH跟踪体内神经元活性降低的可行性。

图6-2 在食物剥夺模型中，pPDH与神经活性负相关

 

7. pPDH揭示了与外侧下丘脑进食行为相关的细胞类型神经动力学

即刻早期基因（IEG）已被证明是研究不同脑区和神经元类型对各类刺激响应的有力工具。研究者继续检测pPDH是否有能力揭示较少被研究的脑区或细胞类型的动力学。

在前述的禁食-重新进食实验中，外侧下丘脑区(LH)有一群离散的神经元在禁食后表现为显著和特异性的pPDH下降，而在重新进食后又迅速恢复表达，表明这群神经元受到禁食激活和再进食抑制。然而，这种抑制并不能被FOS或其他即刻早期基因（IEG）免疫染色检测到。研究者利用pPDH和其他组织学标记物的多重标记发现这个区域的细胞类型。最终发现，Ppdh+神经元与hypocretin而不是MCH或Vgat神经元高度重合。这种由禁食-重新进食诱导的细胞类型特异性抑制在Hcrt-Cre小鼠中被验证，并与近期报道的在饮食过程中hypocretin/orexin神经元失活相一致。因此，pPDH作为一种标志物，可以用来表征一个被禁食激活但被再进食快速抑制的特异性hypocretin/orexin LH细胞群。

图7 pPDH揭示了与外侧下丘脑进食行为相关的细胞类型神经动力学

 

小结

综上所述，本研究通过光遗传技术+磷酸化蛋白质组学筛选发现丙酮酸脱氢酶E1亚基α 1的磷酸化(pPDH)与体外培养的神经元及体内神经元的动作电位放电强度呈负相关，即和神经元的活性呈负相关。研究者证明pPDH在一系列环境中能可靠地反映神经元活动的减少，从而确定pPDH是第一个可追踪的内源性逆活性标志物（IAM）。未来，pPDH染色可与全脑透明、成像或扫描工具相结合，改变我们理解活性双向变化的能力、以更精细的方式研究神经元细胞群，并揭示已建立的和新范式背后的神经回路。

 

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