长期以来，植物生物学家一直对草叶发育有强烈的兴趣，其由茎尖分生组织外围的一圈原生初始细胞发育而来，包含远端用于光合作用的带状叶片和近端包围、支撑茎的鞘状叶基，尽管叶舌和耳廓在进化上具有新颖性和农业重要性，我们对它们形态同源性或发育机制却知之甚少。来自美国康奈尔大学的研究团队在Nature Plants（IF 18.0）发表了题为“A Wox3-patterning module organizes planar growth in grass leaves and ligules”的研究，通过scRNA-seq分析玉米叶原基边缘的“边缘”细胞类型揭示叶片和叶舌具有共同的发育遗传程序，提出了草叶舌同源性作为叶鞘边缘远端延伸的简约模型。

 研究材料 
野生型（WT）和ns双突变体新生叶原基

 技术路线 

步骤1：单细胞转录组学揭示玉米叶缘结构域；
步骤2：叶和叶舌边缘共享转录特征，组织这两种结构的平面生长；
步骤3：探究组织极性与叶和叶舌中Wox3的表达关系；
步骤4：(CRISPR) -Cas9构建四重突变体，揭示Wox3突变体扰乱叶的边缘和侧域原因；
步骤5：生长素运输和冗余Wox3是叶片和叶舌发育所需要的。
 

研究结果

1. 单细胞转录组学揭示叶缘结构域
Wox3家族转录因子NS1和NS2 (NS1/2) 因在叶原基边缘表达受到空间限制，并促进叶的中外侧生长，其可能是叶缘功能的介质。表型正常玉米幼苗(基因型Ns1⁺/ns1;ns2/ns2，即野生型(WT))和ns双突变体表达边缘结构域缺失表型(基因型ns1/ns1;ns2/ns2，即ns)分别进行scRNA-seq，共获得17128个细胞(8717个WT细胞，8411个ns细胞)，确定了两种基因型中与茎、叶原基、脉管系统、表皮和细胞周期相关的主要细胞转录状态，发现Wox3基因Ns1/2和Wox3a/b表达集中在表皮细胞簇(cluster18)。在增殖的S期和G2-M期表皮细胞中也检测到表达，与叶缘是细胞分裂活跃的部位一致，这些表达Wox3的细胞最有可能定义边缘细胞类型。

图1 正常和非正常茎尖单细胞转录组学分析
 

分析表达Wox3细胞的转录特征，发现WT Wox3阳性细胞与其他WT细胞相比上调转录本超过1000个。RNA原位杂交验证其中几个基因的转录本积累在叶片边缘(假定边缘)和WT叶片原基更内侧的表皮下组织层(非边缘)，表明Wox3基因表达域向叶片内侧延伸，ns双突变体的RNA原位杂交表明Ns1/2直接或间接地维持这些转录本在生长叶缘及其内侧的积累。在表皮叶边缘存在一个转录差异、依赖Wox3的细胞群，能够指导叶原基的平面生长。将Wox3最边缘的表达区域称为叶片原始边缘结构域。

图2 scRNA-seq显示了叶片原始边缘的细胞类型
 

2. 叶和叶舌边缘共享转录特征
边缘细胞上调转录本转录因子编码基因Lg1与Ns1/2和Wox3a/b共表达，与先前在叶舌和耳廓形成过程中，Lg1转录物在表皮和内部组织层中积累的报道一致，边缘细胞和叶舌细胞中上调转录本评估两者相似性，发现共享转录本的富集具有统计学意义，这些转录本包括具有生长调节功能的基因，如两个细胞分裂素氧化酶、三个Nga2 /3样基因、生长素反应调节因子侧根原基1 (Lrp1)和MYB家族转录因子编码基因融合叶1 (Fdl1)。表明叶片和叶舌原基都可能有一个边缘结构域的转录特征，能组织这两种结构的平面生长。

图3 叶原基及其舌形叶具有并置在正面-背面区域的边缘细胞
 

3. 组织极性与叶和叶舌中Wox3的表达相关
RNA原位杂交显示Arf3a和Phb转录本在起始叶中积累，表明在正面衍生的唇叶中存在着背向和正面的细胞身份，两个基因的互斥表达在叶舌中却没有很好地定义。结合单细胞转录组数据显示大多数细胞表现出混合身份，具有正面和背面特征，少数细胞具有严格的正面或背面特征。几乎所有cluster18细胞有混合身份，与边缘结构域位于轴向和轴向并置和/或重叠的位置一致，这些结果支持了叶和叶舌都是背侧不对称，并通过在近轴-背向域并置的边缘功能生长。

4. Wox3突变体扰乱叶的边缘和侧域
(CRISPR) -Cas9技术创建玉米Wox3a和Wox3b基因的功能缺失等位基因，F2群体中产生了Ns1/2和Wox3a/b的四重突变体，三突变体ns1;ns2;wox3a植株叶片比WT和ns双突变体的叶片明显变窄、植株高度严重降低、叶片卷曲/扭转增加，ns1/2双突变纯合子和Wox3a突变杂合子植株表现出中间叶表型。在ns双突变背景下，Wox3a突变对中外侧叶片的生长表现出剂量依赖性，Wox3b缺失对ns双突变体或三突变体表型的严重程度没有明显影响，表明Wox3b可能对正常叶片发育是必不可少的，且不能在遗传上补偿平行Wox3缺失。RNA原位杂交分析了发育边界基因Cuc2在横向茎切片中的表达。表明ns双突变删除了边缘域，而Wox3三突变也删除了侧叶域。则Wox3a和Ns1/2冗余表达地促进横向结构域的发育，而只有Ns1/2是SAM边缘结构域生长所必需的。

图4 ns突变体显示细胞转录状态的耗竭
 

图5 高阶Wox3突变体扰乱了叶片原基的中外侧生长
 

5. 基因表达补偿和Wox3冗余
Wox3a/Wox3b双突变叶片中突变表型缺失是由于Ns1/2表达的代偿性变化。检测Ns1/2和Wox3a/b转录本在玉米叶片原基近远端区域的相对积累程度，Wox3a/b转录物积累发生在WT P2叶片原基的上部，而Ns1/2未检测到表达，表明Wox3a/b转录本在叶片原基的远端边缘区域积累得更多。在WT叶片原基中，Wox3a/b和Ns1/2的表达和功能沿叶缘近远轴呈空间分隔，部分重叠。即Wox3a/b在外侧和边缘区域表达，而Ns1/2在边缘区域表达。

6. 高阶Wox3功能和叶舌发育
三突变体中有许多舌片发育缺陷，Wox3b突变对三突变体叶舌缺陷的表型严重程度无影响，表明丧失正面-背面极性不能中断叶舌发育。玉米茎尖分别用对照组培养基(添加二甲基甲酰胺）和实验培养基(含极性生长素运输抑制剂n -1-萘酞酸(NPA)）培养，对照组茎尖启动了正常的叶柄，NPA处理的茎尖中没有观察到叶柄原基，表明叶柄的生长需要生长素运输动力学，支持了叶片和叶舌发育都需要极性生长素运输和冗余Wox3边缘模式功能。

图6 高阶Wox3突变体干扰舌形发育


图7 舌部发育同源性模型


 小编小结 

本研究鉴定一种在叶和叶舌原基边缘表达冗余Wox3功能边缘细胞类型的转录特征，边缘功能受损的高阶Wox3玉米突变体会破坏叶和叶舌的平面中外侧生长，Wox3b突变对三突变叶片或叶舌表型的严重程度无影响，scRNA-seq数据在WT和ns突变体也几乎检测不到Wox3b转录。本研究揭示了草独特的叶舌进化同源性，其是草叶的衍生结构，同源与未加工的叶柄远端边缘。

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