食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种世界范围内的恶性肿瘤，由于缺乏有效的生物标志物，死亡率高，预后差。因此，探索可靠的预后标志物来监测ESCC患者的康复情况以进行个性化治疗是必要的。外泌体是由几乎所有类型的活细胞分泌的直径为30-150nm的细胞外囊泡。它们在调节细胞通信、细胞生长、血管生成和免疫调节方面发挥重要作用。大量研究表明，外泌体主要参与了癌症的发生和进展，并可用于癌症的早期检测、预后和治疗指导。关于食管癌，有报道称外泌体蛋白和RNA都是癌症诊断的潜在生物标志物。而关于外泌体代谢物作为食管癌诊断的生物标志物却鲜有报导。

Nanoscale期刊上发布的题为“Metabolomic analysis of exosomal-markers in esophageal squamous cell carcinoma”的研究结果，研究者通过机器学习分析了复发患者和食管切除术后无复发患者的外泌体的代谢组模式，展示了一个预测ESCC复发的代谢标志物panel，准确率为98%。这些代谢组特征在所有ESCC阶段都保持了很高的差异变化值，并且很可能与癌症代谢相关，有可能作为ESCC诊断和预后的新的生物标志物。

 

91例临床血浆样本，包括34例复发性ESCC患者，37例非复发性ESCC患者和20例健康对照组
 

技术路线

 

重要结果展示

1. ESCC患者血浆外泌体分离和鉴定

介导细胞间通信的外泌体很可能携带与ESCC相关的重要代谢物。在这项工作中，作者使用实验室最近开发的一种从血浆样本中分离和纯化外泌体的方法。然后对分离和纯化的外泌体进行鉴定，包括纳米颗粒跟踪分析（NTA）、western blot（WB）和透射电镜（TEM）。

 

图1 来自不同组的外泌体样本的特征

 

2. 外泌体代谢组分析

接下来，作者从外泌体中提取代谢物，并用靶向UPLC-MS/MS方法对这些化学结构进行表征。共检测到196种代谢物，主要包括脂质脂肪酸、苯及取代衍生物、氨基酸、有机酸、碳水化合物、脂肪酸酰基。在所有代谢物类别中，有机酸及其衍生物和脂质脂肪酸是最丰富的代谢物类型，分别占16.41%和12.31%，脂质组分也占2.56%（图2a）。然后，基于差异代谢物和多变量统计分析，研究了三组间代谢组学模式的变化。正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）（图2b），以最大限度地展示出健康对照组、复发组和非复发组患者的代谢组学分析的差异。随后通过阈值VIP＞1，p<0.05筛选了各组的差异代谢物。图2c展示了差异代谢物对应丰度的聚类分析，各组间存在明显的代谢组学模式变化。进一步对健康对照组、复发组和非复发组间差异代谢物进行venn分析，共观察到12个共有差异代谢物。（图2d）。

 

图2 来自不同研究组的外泌体的代谢组学分析

 

3. 基于机器学习算法筛选ESCC诊断和监测的生物标志物

然后，作者探讨了这些差异代谢物是否可以作为区分复发和非复发患者的标志物。在VIP > 1、p < 0.05和FC的多重选择条件下，得到11个下调代谢物和4个上调代谢物(FC > 1.2或FC<0.83。基于随机森林模型进一步研究了复发和非复发患者的生物标志物。样本随机分为两组，即训练组（25例复发患者和25例非复发患者）和测试组(9例复发患者和12例非复发患者）。在模型构建中，使用森林中所有树木的平均值作为预测重要性的衡量标准。根据Gini指数（节点的纯度）展示前50个候选标记。

随后，作者选择了前4个代谢物（3‘-UMP、棕榈烯酸、棕榈醛、癸酸异丁酯）作为潜在的Biomarker panel，并研究其诊断效力。在主成分分析（PCA）中，该panel可以分离复发和非复发患者。ROC显示了所选标记面板的完美诊断性能，可以预测ESCC的复发，曲线下面积（AUC）为0.98。各代谢物在训练集中的诊断贡献如图所示，3’-UMP的诊断能力最高（AUC = 0.90），癸酸异丁酯为最弱的标记物（AUC = 0.78）。除测试集中的棕榈醛外，其他代谢物的丰度在复发组和非复发组之间均存在显著差异。通过Kaplan-Meier（KM）分析进一步评估这些指标，也显示出了良好的预测ESCC复发的潜力。总的来说，作者研究了复发和非复发患者的外泌体代谢组变化。这些重要的代谢物可能与肿瘤代谢密切相关，并有可能用于ESCC的诊断和监测。

 

图3 基于随机森林模型筛选复发和非复发患者的生物标志物


 

图4 Kaplan-Meier分析对随机森林中选择的代谢标志物进行评估

 结论

这项工作旨在描述ESCC复发患者和无复发患者对ESCC预后的外泌体代谢组学的变化模式。报道了一种基于血浆外泌体的代谢组标记模式，使用随机森林模型，可以预测ESCC的复发，AUC为98%。作者认为，外泌体代谢组学作为系统生物学中一个不断发展的领域，在代谢组补体的全局和差异分析方面具有巨大的潜力，以揭示与细胞表型相关的直接差异。