心动过缓是常见的心血管疾病之一，临床上有效的口服药物很少见。参仙升脉（SXSM）是经国家药品监督管理局许可的一种中药。但其改善人iPSC-CMs（心肌细胞）搏动的胞内分子机制并不清晰。

2023年5月，来自复旦大学中山医院&上海徐汇区中心医院的李华研究团队在Clinical and Translational Medicine（IF=10.6）上发表题为“Transcriptomics, proteomics, metabolomics and network pharmacology reveal molecular mechanisms of multi-targets effects of Shenxianshengmai improving human iPSC-CMs beating”的研究文章。该研究主要通过中药成分解析、网络药理学分析，以及转录组、蛋白质组、代谢组的多组学联合整合分析来揭示参仙升脉通过多重靶向作用改善人源iPSC-CMs搏动的分子机制。中科新生命为其提供了转录组、蛋白质组、代谢组的多组学联合分析技术服务。

 

研究材料

人源iPSC-CMs细胞

 

 实验路线图 

 

研究结果

1. 中药成分组分析

基于UPLC-QTOF-MS/MS和GC–MS与标准中药化学品进行比较，对SXSM的单体成分进行鉴定，去除重复和异构体后，共鉴定出262种候选化合物，列出了一些具有代表性单体组分的化学结构。

 

图1 参仙升脉单体成分鉴定

 

2. 网络药理学分析

基于STRING数据库，构建了化合物和疾病潜在靶标的蛋白质互作网络，得到了150个核心靶标。作者将上述核心靶标进行了GO和KEGG通路富集分析，GO结果表明SXSM可能增加细胞内磷酸化水平并调节细胞内能量代谢环境。KEGG结果发现磷酸化相关的信号转导途径显著富集。

表1 150个核心靶标列表

 

3. 转录组，蛋白组，代谢组多组学分子机制研究

经过药物浓度梯度筛选，最终确定用0.55mg/ml 的SXSM处理人源iPSC-CM细胞1h后收集细胞进行转录组，蛋白组和代谢组分析。

转录组：共筛选到345个差异基因（DEG）。基于GO数据库的GSEA通路富集分析，发现三种钙相关途径的活性增加，也证实了网络药理学中所示的能量代谢的动员作用，并与网络药理学中显示的抗凋亡作用一致，心肌细胞凋亡途径受到抑制；而基于KEGG数据库的GSEA分析发现花生四烯酸代谢具有显著下调趋势。另外，检测到一些显著差异的可变剪接（AS）事件。随后，对从五种AS形式中获得的基因进行KEGG富集分析，结果表明与剪接体、心率升高、能量、钙、磷酸化和抗细胞凋亡直接相关。

蛋白质组：共鉴定到190种差异蛋白。KEGG富集分析结果显示：1）SXSM给药导致人源iPSC-CMs的结构基础稳定，兴奋性收缩偶联增强；2）SXSM给药主要基于氧化磷酸化和TCA循环实现在人源iPSC-CMs上的能量动员；3）剪接体途径（ko03040）在转录组AS（A5SS，RI）和蛋白质组中均富集。SF3B1在转录组AS中检测到，并在蛋白质组中升高，它有助于心肌细胞的能量代谢从脂肪酸代谢（FAO）向糖酵解转变。

代谢组：共检测到138种显著差异代谢物（pos 110，neg 68），并基于KEGG和SMPDB进行了富集分析。结果显示抗衰老和抗细胞凋亡相关途径，以及TCA循环和能量代谢相关的途径显著富集。

 

图2 CTRL vs SXSM的转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析

 

4. 组学与网络药理学整合分析

作者进一步对三种组学进行了联合分析，以阐明分子途径。在“基因-蛋白质-代谢物”维度上进行了二对二分析：即AS事件和蛋白质的互作网络、蛋白质-代谢物相关性网络以及DEG和差异代谢物的O2PLS分析。结果发现：

1）天冬氨酸在代谢组中减少，表明人源iPSC-CMs采用预先储存的氨基酸来发电，而蛋白组也进一步解释了天冬氨酸的减少，即其进入TCA循环以供能。

2）半乳糖代谢中的代谢物（蔗糖、肌醇半乳糖苷、半乳糖醇、蜜二糖）被下调，表明SXSM抑制了半乳糖代谢途径，从而延缓了人源iPSC- CMs的功能障碍。

3）谷氨酰胺在代谢组中增加。此外，谷氨酰胺代谢相关蛋白SLC1A5、GLS、GLUD1、GCLM、SHMT2和GSS增加，进一步解释谷氨酰胺代谢可能具有心脏保护作用。

4）SXSM抗凋亡的其他途径：鞘脂代谢中减少的植物鞘氨醇和鞘氨醇可以阻止mPTP开放，限制线粒体的促凋亡细胞色素C泄漏，保护心肌能量代谢。

 

图3 三组学联合分析

 

5. 机制验证

最后，通过添加KN93（CaM/CaMKII抑制剂）、AIP（CaMKII的选择性抑制剂）、Na+/Ca2+交换剂选择性抑制剂等进行SXSM增强人源iPSC-CMs搏动的多通道验证。结果发现0.55mg/mL SXSM治疗主要触发Ca2+-CaM-AC-PKA途径（一种激活钙库的途径）。

图4 SXSM对人iPSC-CMs钙相关信号通路的验证
 

小编小结

本文分享了中药药效功能机制研究的完整思路--首先通过中药成分分析确定活性成分，再网络药理学预测药物成分的作用靶点及通路，然后又基于转录组、蛋白组、代谢组进一步对预测的功能通路进行验证和补充，最终锁定关键的通路，即SXSM增加人源iPSC-CMs的细胞内钙循环和细胞内钙，并加速兴奋性收缩偶联，同时，SXSM通过充分调动糖酵解途径、氨基酸代谢和脂肪酸β-氧化来促进TCA循环和氧化磷酸化，从而更好地为人源iPSC-CMs供能。本研究可能为无法植入起搏器的心律失常患者提供替代治疗选择。

【中科新生命】以蛋白质组、修饰组、代谢及脂质组等质谱服务为核心，并延伸打造微生物、转录组、时空多组学服务，创建了中药研究与转化创新平台，为您的研究保驾护航！欢迎感兴趣的老师前来咨询。