项目文章 | 转录组测序助力免疫性葡萄膜炎中胆汁酸调控树突状细胞功能机制研究

树突状细胞（DCs）是主要的抗原呈递细胞，在自身免疫性葡萄膜炎中发挥重要作用。新的证据表明，胆汁酸（BAs）调节DCs的成熟。然而，BAs调节DCs功能的潜在机制仍需进一步确定。

重庆医科大学附属第一医院李鸿教授团队等人于7月11日在农业与生物科学领域顶刊International Journal of Biological Sciences（IF 10.75）发表题为“Lithocholic acid inhibits dendritic cell activation by reducing intracellular glutathione via TGR5 signaling”的研究文章，利用转录组测序（中科新生命提供服务）、qPCR、ELISA和Western blot等技术对BAs调节DCs的功能机制进行研究，发现石胆酸（LCA）能通过激活TGR5信号来抑制DCs中谷胱甘肽（GSH）的产生并诱导氧化应激反应，下调NF-κB和MAPK途径，从而抑制骨髓源性DCs（BMDCs）促炎细胞因子的产生并可导致DCs的凋亡和自噬。此外，本研究还发现LCA和TGR5激动剂可能是治疗自身免疫性葡萄膜炎的潜在药物。

    研究材料 TGR5^+/+和TGR5^-/-小鼠来源的BMDCs和视网膜组织、健康人和免疫性葡萄膜炎患者来源的MD-DCs  

技术路线

步骤1：LPS诱导并补充LCA后，BMDCs促炎细胞因子分泌水平、表面标志物和胆汁酸受体表达水平的检测； 步骤2：siRNA抑制TGR5和FXR表达后，BMDCs促炎细胞因子分泌水平、表面标志物表达水平的检测； 步骤3：补充LCA后，自身免疫性结膜炎小鼠模型（EAU）病理特征、免疫细胞和促炎细胞因子水平检测； 步骤4：使用人源MD-DCs进行步骤1-3实验结果的验证； 步骤5：转录组测序检测LCA处理后TGR5^+/+ vs TGR5^-/- BDMCs基因表达和功能富集差异； 步骤6：LCA和TGR5激动剂处理后，TGR5^+/+ vs TGR5^-/- BDMCs表型和分子特征检测。

研究结果

1. BAs可抑制促炎细胞因子的产生和DCs表面标志物的表达

LPS诱导BMDCs后，补充BAs能抑制几种促炎细胞因子的分泌，并抑制BMDCs表面标记物CD40、CD86、CD80和MHCII的表达，其中LCA效果最为显著（图1）。

图1 BAs可抑制促炎细胞因子的分泌和DCs表面标志物的表达

 

2. LCA通过TGR5信号抑制DCs促炎细胞因子分泌，减轻小鼠EAU的严重程度

QPCR结果表明，LCA诱导BMDCs中FXR和TGR5的mRNA表达，INT-777、747（TGR5特异性激动剂）显著抑制BMDCs中促炎细胞因子的分泌（图2 A、B）。使用siRNA抑制BMDCs中TGR5、FXR的表达，结果表明抑制TGR5表达能更大程度上逆转LCA对细胞因子分泌的抑制作用，并在TGR5^-/- BMDC的体外实验中发现了类似的结果（图2 C-G）。以上结果表明，LCA通过TGR5信号调节DCs的功能。

图2 LCA通过TGR5信号通路抑制DCs中促炎细胞因子的分泌

此外，TGR5^+/+小鼠补充LCA可抑制小鼠病理表现、保护小鼠视网膜血管完整性、显著改善EAU的严重程度并减缓其进展，TGR5^-/-小鼠中这种效果则发生逆转（图3）。

图3 LCA通过TGR5信号通路减轻小鼠EAU的严重程度

 

3. LCA通过TGR5信号通路抑制DCs的抗原呈递功能及MD-DCs的激活

体外实验表明，补充LCA的TGR5^+/+ EAU小鼠中分离的CD11c⁺ DCs显著抑制Th17、Th1细胞的分化以及IFN-γ和IL-17的分泌，而这种现象在TGR5^-/-组中发生逆转（图4 A-C）。体内实验（小鼠脾脏和视网膜组织）观察到类似的结果（图D-E）。

图4 LCA通过TGR5信号通路抑制DCs的抗原呈递功能

人源MD-DCs细胞体外培养实验进一步验证了上述结果（图5）。

图5 LCA通过TGR5信号抑制MD-DCs的激活

 

4. TGR5信号通过抑制GSH的产生和诱导氧化应激反应来抑制DCs产生促炎细胞因子

对LPS诱导并补充LCA处理后的TGR5^+/+ vs TGR5^-/- BDMCs进行RNA-Seq，共检出1584个DEGs（其中上调641个，下调943个）。KEGG pathway富集分析显示TGR5^+/+组中24条途径上调（如核糖体表达、GSH代谢途径等），12条途径下调（如磷脂酰肌醇信号系统、HIF-1信号通路等）（图6）。

图6 TGR5信号通路调节DCs内GSH代谢

通常GSH缺乏会抑制DCs成熟和促炎细胞因子的产生，体外实验表明补充LCA和INT-777、747可显著抑制TGR5^+/+组细胞内抗氧化酶活性（包括GSH过氧化氢酶、过氧化物酶等），诱导ROS积累，而TGR5敲除则会逆转这些结果（图7 A-D）。使用GSH还原型乙酯（GSH OEt）增加TGR5^+/+ BMDCs中GSH的表达后，促炎细胞因子分泌水平增加（图7 E）。

图7 TGR5的激活通过抑制GSH的产生、诱导氧化应激来抑制DCs中促炎细胞因子的分泌

 

5. LCA通过TGR5信号通路促进DCs凋亡和自噬

相较于TGR5^-/-，补充LCA增加了TGR5^+/+ BMDCs中膜联蛋白+7AAD细胞的比例，并增加与细胞凋亡相关蛋白Bax和C-caspase3的表达，降低BCL-2的表达（图8 A-C）。此外，LCA增加了参与自噬的2种蛋白LC3II/LC3I比率和Beclin1的表达（图8D）。这些结果表明LCA可促进BMDCs凋亡和自噬。

 

图8 LCA通过TGR5信号通路促进DCs的凋亡和自噬
 

小编小结

本研究表明，BAs抑制DCs中促炎细胞因子和表面标志物的表达，LCA效果最为突出，其中TGR5是LCA最有效的下游靶点。LCA通过TGR5信号抑制DCs激活，通过减少GSH产生，下调NF-κB和MAPK途径从而降低促炎细胞因子分泌，并促进DCs凋亡和自噬，以调节自身免疫性葡萄膜炎的发展。此外，本文研究结果表明，LCA和TGR5激动剂是治疗自身免疫性疾病和炎症性疾病（包括自身免疫性葡萄膜炎）的潜在治疗药物。