Cell Metabolism：揭开「沉默的杀手」面纱，代谢组学＋蛋白质组学进行高级别浆液性卵巢癌分型

Cell Metabolism IF=20.565

127 例 HGSOC 样本（居里队列）。其中，45 例样本用于代谢组分析，127 例用于蛋白质组分析，71 例用于免疫组化分析。另外，169 例样本的转录组数据来自于 TCGA 数据库。此外，若干epithelialovarian cancer cell lines（OCCL）用于体外实验。

实验流程

作者利用共识聚类法发现 HGSOC 最优的聚类是分为 2 个亚型，该结果在 Cancer Genome  Atlas（癌症基因组地图，TCGA）队列中被证实，并将这 2 种亚型命名为 low-和 high-OXPHOS。
 

利用非靶代谢组学对 45 例 HGSOC 样本进行分析，结果也证实了以上 2 种 OXPHOS 亚型。对 41 种差异代谢物进行聚类分析，结果发现 high-OXPHOS HGSOCs 显著积累氧化还原反应辅助因子，比如 FAD、CoA、TCA 中间产物（苹果酸）、乙醇 an 和胆碱家族（甘油酯中间产物）以及戊糖磷酸途径中间产物。Low-OXPHOS HGSOCs 主要积累谷胱甘肽代谢和胆碱中间产物。
 

蛋白质组学和代谢组学的结果整合：将 low-和 high-OXPHOS 中找到的差异蛋白和差异代谢物在代谢通路上进行整合，结果表明线粒体代谢通路重塑在 HGSOC 中的关键作用。
 

2、High-OXPHOS 卵巢癌细胞依赖于 TCA 循环，Low-OXPHOS 主要利用糖酵解途径。
 

WB 结果表明 5 个 ETC 蛋白能够将 low-和 high-OXPHOS 卵巢癌细胞系（OCCLs）区分。电子显微镜等实验结果显示具有高表达水平的 ETC 蛋白的 high-OXPHOS 细胞系中线粒体含量、线粒体染色、线粒体跨膜电位显著提高，而且 high-OXPHOS 细胞系具有更高的耗氧率（OCR）。这些结果表明 ETC 蛋白表达水平与线粒体呼吸能力之间的功能相关性。
 

为了研究卵巢癌细胞系 2 个亚型中 TCA 循环利用的碳源，作者检测了外源添加葡萄糖时 high- 和 low-OXPHOS OCCLs 的细胞外酸化速率（ECAR）都提高但是耗氧率不一样。说明这 2 个亚型都是用葡萄糖进行糖酵，而 high-OXPHOS OCCLs 是利用谷氨酰胺进行线粒体呼吸。代谢流分析的结果也证实在 high-OXPHOS OCCL 中 TCA 循环更活跃，谷氨酰胺更有效的结合。high-OXPHOS OCCL 对脂肪酸氧化（FAO）抑制剂更敏感说明其细胞也用脂肪酸进行线粒体呼吸。
 

3、High-OXPHOS 卵巢肿瘤显示慢性氧化应激特征。
 

OXPHOS 信号在居里队列中和 HRD 显著相关，在 TCGA 队列中呈现相似的趋势，但是不显著。在之前研究中报道，HRD 和慢性氧化应激相关。作者检测了居里队列和 TCGA 队列（KEAP1 无任何有害突变）high-OXPHOS 亚型中，NFE2L2 (NRF2)-依赖的抗氧化反应，结果都上调；抗氧化酶的蛋白表达水平也显著提高。之后，作者 high-OXPHOS HGSOC 中检测到了更多的氧化蛋白（羰基化蛋白/总蛋白）、脂质氧化产物（比如在 sn-2 位置带乙酰链的磷脂），更少的谷氨酰胺中间产物。在 high-和 low-OXPHOS OCCLs 检测 ROS、脂质过氧化水平以及溶酶体 Fe2+ 浓度，结果表明 high-OXPHOS 细胞系中更高。以上结果证实了 high-OXPHOS 细胞遭受慢性氧化应激。
 

4、PML 核小体（NB）在 high-OXPHOSHGSOCs 中积累并通过 PGC-1α 调控在 OXPHOS 信号中起到关键作用。

之前的研究结果表明 ROS 产生激活信号，PML 因子是氧化应激的靶标，聚合受 ROS 调控。通过免疫组化（IHC）比较 low-和 high-OXPHOSHGSOCs 中 PML 蛋白水平和核小体数目，结果显示 high-OXPHOSHGSOC 显示更强的 PML 组织学得分（Hscore），每个细胞的 PML-NBs 含量更高。在 TCGA 中，PML 蛋白和 mRNA 表达水平在 high-OXPHOS HGSOC 中更高。以上结果表明 PML 和 HGSOC 队列中 OXPHOS 状态有关。

在 OCCLs 中沉默 PML 基因，结果表明，high-OXPHOS 细胞系 OCR 降低（low-OXPHOS 细胞系的 OCR 不受影响），脂肪酸氧化抑制显著降低说明 PML 对于 high-OXPHOS 细胞系中的脂肪酸氧化以及谷氨酰胺回补起到关键作用。
 

PGC-1α 的去乙酰化能引起 ETC 基因转录水平上调，PML 在乳腺癌中是 PGC-1α 的上游激活子，因此作者检测了 high-OXPHOS 细胞系中 PML 沉默后，PGC-1α 蛋白和 mRNA 的表达水平，结果没有影响，但是 PML 沉默增加了 PGC-1α 的乙酰化，因此降低了其转录活性。PGC-1α 沉默降低了呼吸能力以及 ETC 蛋白的表达。以上结果表明 HGSOC 中，PML 通过调节 PGC-1α 转录活性，随后 ETC 基因表达和线粒体呼吸，从而在 OXPHOS 代谢中起到关键作用。
 

5、HGSOC 病人中 high-OXPHOS 代谢显示更好的预后。

high-OXPHOS 代谢和肿瘤治疗反应相关有着争议。为了研究卵巢癌标准化疗后（铂盐及紫杉烷），HGSOCs 的 OXPHOS 分类，作者建立了卵巢癌病人来源异种移植（PDX）小鼠模型，包括 HRD 状态以及响应化疗的模型。ETC 蛋白表达水平在 high-OXPHOS PDX 中显著升高，线粒体面积也更大。化疗后（卡铂或者紫杉醇处理），肿瘤的生长速度都受到抑制，但是 high-OXPHOS PDX 模型肿瘤生长抑制更显著。说明 PDX 中 OXPHOS 状态与化疗响应相关。

在临床上证明高 ETC 蛋白水平（确认 high-OXPHOS 状态）与良好的患者生存率相关。实验数据也证实根据 PML Hscore 将 HGSOCs 分为两亚组，对患者存活率有参考性。high-PML Hscore 与更好的病人预后相关，而且多集中在 high-OXPHOS 肿瘤。
 

6、High-OXPHOS 代谢通过协调 ROS 水平增强化疗敏感性。

与 PDX 和临床样本结果一致，high-OXPHOS 细胞系对卡铂和紫杉醇显示更高的化疗敏感性，而 PML 和 PGC-1α 沉默显著降低化疗敏感性；PDX 中 PML 沉默也显著降低化疗敏感性，说明 PML 能协调化疗敏感性。卡铂和紫杉醇处理 OCCLs 能显著增加 ROS 含量，high-OXPHOSPDX 中线粒体的超微结构发生改变和嵴瓦解。PML 沉默能增加 ROS 浓度、脂质过氧化以及溶酶体 Fe2+ 浓度，说明 ROS 含量是 high-OXPHOS 细胞系化疗敏感性的关键因素。Ironomycin 显著增加 high-OXPHOS 细胞系铁的积累，活性氧和脂质过氧化，对 low-OXPHOS 细胞无显著影响，而 PML 沉默降低 high-OXPHOS 细胞对 Ironomycin 的敏感性。这些结果说明增强 high-OXPHOS 细胞系化疗敏感性依赖于 ROS 的积累、线粒体改变以及可能的细胞铁死亡。
 

结论：
 

1、作者通过蛋白质学+代谢组学的分型结果，首次证明了 HGSOC存在代谢异质性，并能够以此进行分型。

2、通过后续代谢流分析、分子生物学等实验，解析了 High-OXPHOS HGSOC 增强化疗敏感性的具体机制。

3、在上述基础上，通过与临床相关数据的联合分析，进一步寻找到了与特定肿瘤亚型的预后相关的诊断指标。
 

该研究为从代谢层面进行肿瘤分型、诊断与治疗，提供了新的研究模式和方向。