Ecotoxicol Environ Saf | 汕大医附二院钟晓平/陈嘉胜团队揭示香烟烟雾提取物影响颅面软骨发育的关键机制

烟草烟雾（TS），特别是二手和三手烟，是一种普遍而棘手的环境危害，促进颅面畸形进展，但其潜在机制尚不清楚。2024年11月来自汕头大学医学院第二附属医院钟晓平、陈嘉胜团队在Ecotoxicology and Environmental Safety发表题为“Elucidating tobacco smoke-induced craniofacial deformities: Biomarker and MAPK signaling dysregulation unraveled by cross-species multi-omics analysis”的研究，以斑马鱼和HEPM细胞为模型，研究香烟烟雾提取物（CSE）对颅面软骨发育的影响，通过跨物种多组学分析，确定与CSE诱导的颅面软骨畸变相关的关键生物标志物和关键调控途径。中科新生命提供单细胞转录组、转录组、蛋白组、代谢组服务。    


  斑马鱼和HEPM细胞


  步骤1：CSE暴露诱发斑马鱼幼鱼颅面异常； 步骤2：鉴定CSE影响下的颅面发育关键生物标志物及MAPK信号通路； 步骤3：基于MAPK信号的scRNA-seq分析突显间充质细胞在CSE诱导颅面畸形中的核心角色； 步骤4：CSE诱导HEPM细胞氧化应激及凋亡； 步骤5：HEPM细胞候选标志物的功能分析及解析MAPK通路的关键调节因子。


  1. CSE暴露导致斑马鱼幼鱼颅面异常 斑马鱼幼鱼经CSE暴露后，出现颅面软骨发育异常，表现为软骨长度缩短和软骨间角度异常。 图1 香烟烟雾提取物暴露影响斑马鱼幼鱼颅面发育   2. 鉴定CSE影响下的颅面发育关键生物标志物 构建颅面发育相关的miRNA-mRNA 网络，结合实时定量PCR，鉴定出dre-miR-96–5p、dre-miR-152、dre-miR-125b-2–3p、dre-miR-181a-3–3p作为颅面软骨发育的关键生物标志物。 图2 2.5% CSE暴露的斑马鱼幼鱼颅面发育相关基因和miRNA   3. miRNA和mRNA水平的功能富集分析揭示MAPK通路的关键作用 功能分析揭示这些miRNA与MAPK信号通路、氧化应激和细胞分化发育相关，强调MAPK信号通路作为关键的中枢通路。 图3 斑马鱼幼鱼miRNA和基因水平的交集富集结果   4. 基于MAPK信号的scRNA-seq分析揭示间充质细胞在颅面发育中的关键作用 2.5% CSE暴露的斑马鱼幼鱼进行scRNA-seq并结合两种通路评分方法，发现在间充质细胞（MCs）、淋巴管内皮细胞和浦肯野细胞中MAPK通路活性相对较高。且与其他细胞类型相比，仅有MCs显著富集MAPK信号通路，这提示具有明显MAPK信号激活的MCs在CSE诱导的颅面畸形中起着关键作用。 图4 斑马鱼幼鱼单细胞转录组学分析   5. CSE诱导HEPM细胞氧化应激及凋亡 CSE暴露引起HEPM细胞内ROS产生增加和MMP下降，导致细胞生长抑制和凋亡率上升，表明氧化应激在CSE诱导的细胞损伤中起重要作用。 图5 CSE暴露通过活性氧介导HEPM细胞抑制细胞生长和诱导凋亡   6. 候选生物标志物在HEPM细胞中的功能分析 聚焦于HEPM细胞中的四种候选miRNAs: hsa-miR-96-5p、hsa-miR- 125b-2-3p、hsa-miR-152-3p和hsa-miR-181a-3p，通过DEG富集结果交集分析阐明这些人类生物标记物的潜在功能，发现miR-96-5p、miR-125b-2-3p和miR-152-3p主要参与PI3K、MAPK、TNF和WNT等信号通路，且与细胞和器官发育的调节有关。这与斑马鱼候选miRNAs功能几乎一致。 图6  2% CSE暴露的HEPM细胞中候选miRNA的核心功能   7. HEPM细胞的多组学分析确定关键的MAPK通路调节因子 HEPM细胞的转录组进一步验证了MAPK信号通路的异常激活，同时对HEPM细胞的三组学进行差异分析，确定MAPK通路中的差异基因、蛋白组、代谢物。并用相关性分析及通路注释确定各个分子在MAPK通路上的关系。 图7  HEPM细胞的综合多组学分析


  本研究通过开创性的跨物种多组学分析，揭示CSE诱导的跨物种颅面畸形的潜在机制，确定颅面软骨发育中潜在的重要生物标志物（miR-96-5p， miR-152/miR-152-3p和miR-125b-2-3p），其表达失调可能引发Wnt和MAPK信号通路等异常，最终导致颅面畸形，其中，MCs中与OS相关的MAPK信号通路的失调在CSE引起的颅面发育异常中起着至关重要的作用，为更全面地了解其病因奠定了基础。


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