10×单细胞转录组常见Q&A（二）｜实验质控相关

 

各位老师大家好！新一期10×单细胞转录组常见Q&A又来了！上一期中，我们介绍了单细胞实验开展前最需要了解的几大问题（点击阅读）。这一期，我们将为大家介绍单细胞实验环节中的质控细节。

01 transcriptional bursting

首先，给大家介绍转录表达中的一个现象：转录爆发（Transcriptional bursting），是指基因会从沉默的状态突然切换为激活态，启动转录、并在短时间内（通常不超过2-3min）急剧生成产生大量RNA；然后再次进入沉默的状态。

 

图1 显微镜下转录爆发现象的示意图
 

我们都知道，基因的转录和表达是有周期性的。当基因的转录被激活时，mRNA的水平会突然上升，然后慢慢下降，而相应的蛋白水平的变化会有一定的滞后。这种周期的频率，以及每次波动的大小，在RNA分析中都会影响最终的表达量（可以是FPKM值、RPKM值）。这种周期性的转录现象，就是同transcriptional bursting有关。

 

02 单细胞实验整体流程

在bulk RNA测序过程中，由于RNA提取、反转录和PCR扩增流程，会存在偏好性的问题。同样的，单细胞转录组实验中也存在偏好性，如扩增、Drop-out rates（有部分高表达的mRNA 无法被扩增出来）、Transcriptional bursting、背景噪音、细胞周期与细胞大小、以及批次效应带来的偏好性。

单细胞实验整体流程如下图，接下来给大家详细讲解一下哪些实验环节会带来偏好性，以及如何发现和质控。

图2 单细胞实验整体流程图

 

2.1 细胞分离

我们在做单细胞测序的时候，首先要做细胞分离。细胞分离必须要在较短时间内完成，否则会影响到细胞的状态，甚至可能导致RNA从细胞中漏出。

从组织中分离出单细胞可能遇到的问题：

· 细胞分离的不彻底，存在多个细胞黏连到一起的情况； · 细胞分离条件对所有细胞类型不适中，会对一些细胞造成损伤，使RNA溢出； · 溢出的RNA，导致了背景信号。