Significant and unique changes in phosphorylation levels of four leaf phosphoproteins in two apple rootstock genotypes under drought stress.

干旱胁迫对于植物来说，是一个全球普遍存在的问题。会限制植物的生长发育。西北是我国苹果的最大产区，长期的中度干旱是限制苹果产业发展的一个重要因素，然而目前果树方面关于中度干旱胁迫响应的分子机制研究较少。

样本来源

苹果砧木叶片组织，4组样本分别来源于干旱敏感型材料M26（干旱处理、对照）、干旱耐受型材料MBB（干旱处理、对照）。

技术路线

iTRAQ，三个生物学重复

研究结果

1. 中度干旱胁迫响应的生理变化

研究团队测定了4组样本的相对含水量（RWC）、叶面积（LA）、比叶重(LMA)、游离脯氨酸含量(CFP)、可溶性糖含量(CSS)、丙二醛含量 (MDA)。生理实验结果显示，RWC, CFP, CSS以及MDA的变化可能会影响苹果砧木对于中度干旱耐受程度。与M26相比，MBB在中度干旱胁迫下能够产生更多的渗透调节物质。

2. 磷酸化修饰位点以及磷酸化蛋白鉴定
本次共鉴定到595个磷酸化肽段，682个磷酸化修饰位点以及446个磷酸化蛋白。这682个磷酸化修饰位点分别位于丝氨酸（86.95%）、苏氨酸（11.73%）以及酪氨酸（1.32%）。

磷酸化修饰位点分布

3. 差异磷酸化蛋白鉴定及生物信息学分析
通过分别与对照比较，中度干旱胁迫下的M26和MBB中，磷酸化水平显著变化的蛋白分别为5个和35个。其中4个在两个材料中都有，这有可能是两个基因型在响应干旱胁迫的机制方面有一些相似之处。在本次鉴定446个的蛋白中，有26个为蛋白激酶，其中10个为常见的干旱胁迫响应激酶，但在本次研究中，这些激酶几乎都没有表现出显著的表达差异。

在获得差异磷酸化修饰肽段及蛋白信息后，研究团队进行了GO分析。结果表明这些差异磷酸化蛋白与代谢、转录、翻译和蛋白加工等有关。

差异蛋白质的Venn图

差异磷酸化蛋白质的GO功能分析

随后，研究团队利用motif-X对于差异蛋白的磷酸化修饰进行特征分析，结果表明，在差异磷酸化蛋白中，磷酸化修饰均位于丝氨酸，且[PxsP], [sP], [sD], [Rxxs], [sxP] 和 [sxs]等6种修饰特征最为普遍。

差异磷酸化蛋白质的修饰特征分析

4.  qRT-PCR 验证
研究团队选择了17个基因进行qRT-PCR 验证。结果表明，M26中ACBP4基因表达水平下降，此时蛋白磷酸化修饰水平上升。在MBB中，RPL5, eIF3B, Hsp70, Hsp70-90, DEK 以及 TUBA3在表达水平显著增加，与磷酸化水平变化趋势一致。这些结果表明，在中度干旱胁迫下，苹果砧木的mRNA与蛋白磷酸化修饰的变化有一定的相关性。

qRT-PCR 验证

小编心得

本文利用蛋白质组学技术（iTRAQ）对比了干旱敏感基因型材料M26以及干旱耐受型MBB在中度干旱胁迫条件下的生理学和磷酸化蛋白组方面的变化。通过目前常见的生信分析（GO、Motif-X）以及验证手段（qPCR）获取可信度较高的目标性磷酸化修饰蛋白质，为进一步的安涛苹果中度干旱耐受的分子机制，提供更为准确的研究范围。